Utilidad de la Biología Molecular en Cirugía

Generalidades de Biología Molecular (BM)

Introducción

Los seres vivos están constituidos por agregados de células con morfología y funciones específicas, que se dividen autónomamente. Las células son, pues, entidades individuales cuya esencia es precisamente la capacidad de crecer y dividirse generando células hijas. La integridad de las células se mantiene por una membrana (plasmática o celular) compuesta de proteínas y lípidos que la separa del medio circundante y de otras células y que le permite el paso selectivo de sustancias. En el interior de las células existe un orgánulo más o menos esférico, el núcleo, que contiene los cromosomas, que están formados por largas moléculas de DNA asociados a proteínas y que constituyen el sustrato del material genético. La mayor parte de los miles de reacciones químicas que aseguran el mantenimiento de la estructura y función celular tiene lugar a una velocidad adecuada, gracias a la acción de las enzimas. Cuando una enzima no se sintetiza en concentraciones óptimas, o tiene un funcionamiento incorrecto, la célula sufrirá los efectos del mal funcionamiento del proceso afectado por esta enzima. Todas las enzimas son proteínas y casi todas las proteínas son enzimas. Las proteínas están constituidas por uno o más polipéptidos, que son cadenas de aminoácidos. Existen 20 aminoácidos distintos. Hoy sabemos que la actividad de las distintas enzimas depende de la secuencia de los aminoácidos que las forman, y que la información que determina el orden correcto de los aminoácidos de cada enzima celular reside en las moléculas de DNA de los cromosomas.

Genes y Material Genético

El DNA no sólo lleva esta información esencial, sino que es además capaz de autorreplicarse, es decir, de dar lugar a nuevas copias de sí mismo, de manera que cuando la célula se divide para originar dos células hijas, ambas adquieren copias iguales del DNA. Esta capacidad de asegurar la transmisión de la especificidad de las proteínas celulares es esencial para la vida y constituye la base de la genética. Los genes son partes de la molécula de DNA que forman los cromosomas, y que codifican la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o proteína. Por tanto, los genes residen en los cromosomas que están localizados en el núcleo de las células y que son los transportadores de la herencia. Cada una de las aproximadamente 1013 a 1014 células (diez a cien billones) del cuerpo humano contiene el mismo número de cromosomas (46) y, por lo tanto, el mismo número de genes (de unos 70.000 a 100.000). El contenido total de DNA de una célula se denomina genoma, y al conjunto de caracteres genéticos de una especie que éste determina, genotipo.

El gen es la unidad de la herencia. Aunque en principio, un gen es una entidad estable, está sujeto a la posibilidad de cambios, denominados mutaciones. Las mutaciones pueden ser silenciosas, si no producen defectos en las proteínas, o bien pueden causar una alteración en su funcionamiento, o incluso suprimir su expresión, con consecuencias que dependerán del papel de la proteína de que se trate. Las mutaciones se transmiten a las células hijas de modo estable. Las mutaciones individuales pueden dar lugar a alteraciones detectables, o por el contrario, ser necesarias varias mutaciones para afectar la apariencia o características visibles del organismo. Esta apariencia o expresión física de los genes es el fenotipo, que es el resultado visible del genotipo. El genoma humano consiste en moléculas de DNA en forma de doble hélice en la que las dos cadenas están químicamente unidas por enlaces débiles de puentes de hidrógeno. Cada cadena de DNA está constituida por una sucesión lineal de moléculas de desoxiribosa unidas por un grupo fosfato. Unida a cada desoxiribosa hay una base nitrogenada, de las que existen cuatro tipos: dos piridinas, citocina (C) y timina (T) , y dos purinas, adenina (A) y guanina (G). La unidad básica del DNA es el nucleótido, constituido por una molécula de desoxiribosa a la que se une un grupo fosfato y una base nitrogenada. La información genética está codificada por la secuencia de bases.

El proceso de replicación o síntesis de las moléculas del DNA constituye una etapa del ciclo de proliferación celular previa a la división de una célula en dos células hijas, o mitosis. Las dos cadenas de DNA se separan y dan lugar a una copia complementaria en un proceso dirigido por la enzima DNA polimerasa. El resultado son dos moléculas idénticas a la parental, cada una de las cuales constituirá el material genético de la progenie.

Regulación de la Expresión Génica

Aunque parezca sorprendente, sólo una pequeña parte del genoma humano (del 2 al 3%) tiene capacidad codificante, es decir, está constituido por secuencias de DNA que especifican un polipéptido o un RNA funcional. La gran mayoría del DNA es no codificante o extragénico. La correlación entre la localización relativa de las mutaciones ocurridas en la secuencia de nucleótidos de un gen y la ubicación de los cambios en las cadenas de aminoácidos originados por ese gen, indica la existencia de unas reglas en el traspaso de la información contenida en la secuencia ordenada de las cuatro bases (A,T,G,C) en el DNA, a la de los veinte aminoácidos que construyen las proteínas. Estas reglas constituyen el denominado código genético, en el que tres bases de DNA, es decir un codón, codifican un aminoácido.

El hecho de que el DNA se encuentre en el núcleo de las células, mientras que los orgánulos donde se sintetizan las proteínas, los ribosomas, se hallan en el citoplasma, sugiere la existencia de un mecanismo de transferencia física de la información del código genético desde el núcleo hasta el citoplasma. Este mecanismo consiste en la síntesis en el núcleo y a partir del DNA de los genes, de unas moléculas intermediarias denominadas ácidos ribonucleicos (ARNs). Los ARN son sintetizados, en un proceso llamado transcripción, a partir de una de las cadenas del DNA de los genes por acción de las enzimas denominadas RNA polimerasas. Estas moléculas de RNA, denominadas RNA mensajeros (RNAm) son transportadas al citoplasma donde la información que contienen en forma de secuencia de bases (A, U, G, C) es traducida a una secuencia específica de aminoácidos durante el proceso de síntesis de proteínas o traducción. Por lo tanto, los cambios que ocurran en la secuencia de bases en el DNA de los genes se convertirán primero en alteraciones en la secuencia de bases del RNA, y luego en cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas.

Todas las células del organismo están sometidas a un riguroso control de su proliferación y diferenciación. Estos procesos están regulados por sustancias denominadas factores de crecimiento y diferenciación. Fenómenos como la apoptosis o muerte celular programada y la senescencia, constituyen mecanismos de regulación complementarios a éstos, contribuyendo al establecimiento de un equilibrio entre la división y la muerte celular por procesos naturales en todos los tejidos. Una notable excepción a este control y equilibrio lo constituyen las células cancerosas que tienen la característica de propagarse indefinidamente en su ubicación normal o de crecer en localizaciones extrañas a su emplazamiento natural, fenómenos derivados de la pérdida del control de su proliferación o de respuesta a las señales que ordenan su eliminación controlada por apoptosis.

Los avances recientes en BM han permitido identificar mas de 100 genes diferentes relacionados con la aparición de tumores y clasificarlos en base a su función. Estos genes se pueden agrupar en cuatro categorías fundamentales: Oncogenes, genes supresores, genes reparadores y genes reguladores de la apoptosis.

Oncogenes

Oncogenes

Su función es la regulación de la proliferación celular. Tras su alteración se activan de forma constitutiva, manteniendo la señal mitogénica (de división celular) permanentemente activa. Se han identificado más de 80 oncogenes, divididos en cuatro subgrupos o niveles que representan diferentes tipos de actividades:

a) Mensajeros primarios, fundamentalmente factores

de crecimiento y hormonas.

b) Oncogenes semejantes a receptores para factores de crecimiento. Su acción oncogénica está directamente relacionada con la capacidad de fosforilar residuos de tirosina de diferentes substratos intracelulares. El EGFr y sus homólogos (neu, erb-B3, erb-B4), destacan por su incidencia en tumores humanos.

c) Proteínas citoplasmáticas traductoras de señal.

Incluyen diversos enzimas responsables de la generación de segundos mensajeros como son las GTPasas de la familia Ras.

d) Factores de Transcripción. Los más conocidos son fos, jun y myc, que representan tres familias de factores de transcripción diferentes.

Genes Supresores de Tumores

Son genes cuya función primordial es la de frenar la proliferación celular, imprescindible para el normal funcionamiento de la célula y del organismo. Es la pérdida de su función lo que contribuye a la aparición de los tumores. Se conocen muchos genes supresores tumorales, de los cuales los dos mejor caracterizados son el del retinoblastoma (Rb) y p53.

Genes Reparadores

Las mutaciones que se producen de forma espontánea por errores de la DNA polimerasa, o de forma inducida por agentes mutágenos externos, se reparan en un altísimo porcentaje gracias a la existencia de una sofisticada maquinaria molecular encargada de esta función. Sin embargo, estos genes también son susceptibles de sufrir alteraciones y ser responsables entonces de la aparición al azar de numerosas alteraciones genéticas, que afectan a la función de proto-oncogenes, genes supresores, etc... De esta manera, alteraciones en los genes reparadores pueden contribuir en una fase inicial a la aparición de numerosas mutaciones. Se han detectado mutaciones en algunos de estos genes, en células de la línea germinal de pacientes con una historia de cáncer colorrectal hereditario no polipósico (HNPCC o síndrome de Lynch).

Genes Reguladores de la Apoptosis

Una gran diversidad de factores extracelulares e intracelulares modulan la apoptosis (o muerte celular programada) entre los que se incluyen oncogenes, genes supresores y diversos componentes del ciclo celular. La apoptosis implica toda una serie de cambios morfológicos y bioquímicos, que incluyen: repliegues en la membrana, condensación de la cromatina, fragmentación celular, expresión de opsoninas. Es un proceso rápido que típicamente dura de 30 minutos a unas pocas horas.

Otros genes, no incluidos en estas cuatro categorías, pueden jugar un papel esencial en la aparición o en el mantenimiento del fenotipo neoplásico, como por ejemplo el gen de la telomerasa y los genes responsables de la regulación del angiogénesis, por lo que quizás en un futuro próximo se deba ampliar esta clasificación. La telomerasa es una ribonucleoproteína responsable del mantenimiento del contenido genético de las células hijas durante la división celular, eludiendo el proceso de la senescencia que es consecuencia de la pérdida de material genético inherente a cada duplicación celular. Recientemente se ha demostrado que la angiogénesis juega un papel esencial en el crecimiento de los tumores primarios y su expansión metastásica.

Aplicaciones de Biología Molecular

Los sorprendentes avances de la BM en los últimos años, han permitido profundizar en el conocimiento de las alteraciones genéticas subyacentes en diversas enfermedades. En el caso de la Cirugía, estos conocimientos han tenido una aplicación importante en Cirugía Oncológica. Es así que, para hablar de las aplicaciones de BM, voy a hacer referencia a la utilización de técnicas moleculares en el diagnóstico y pronóstico de procesos neoplásicos de forma directa o indirecta.

Factores Diagnósticos

La alta sensibilidad de las técnicas de BM nos permiten detectar la presencia de células neoplásicas en una muestra mayoritariamente compuesta de células normales y con muy poco contenido de células tumorales. Tal es el caso de la detección de mutaciones en el oncogen k-ras en la valoración de pacientes con masas pancreáticas. Considerando que la mayoría (60-100%) de los carcinomas de páncreas contienen mutaciones en el codón 12 del gen k-ras, se han realizado diversos estudios, en los cuales se ha podido demostrar la utilidad de la detección de mutaciones en ras como marcador tumoral a nivel tisular. Un trabajo retrospectivo reciente que incluyó 93 pacientes, demostró que la detección de mutaciones en el oncogen k-ras habría sido de utilidad en 14 de 30 pacientes con diagnóstico no concluyente (células sospechosas [12], células benignas [12] y material insuficiente [6]).

Así como se puede detectar una célula neoplásica en medio de 1000 o hasta 10.000 células normales, utilizando técnicas de BM se detectan microorganismos que pueden estar muy poco representados en las muestras de estudio. Tal es el caso de infección por Helicobacter pylori, bacteria que está estrechamente relacionada con cáncer gástrico. En el Instituto de Biología Molecular de la Universidad Católica de Santiago de Guayaquil, hemos puesto a punto una técnica para la detección, mediante BM, de infección por Helicobacter pylori en biopsias gástricas obtenidas mediante gastroscopía. Nuestros resultados preliminares, de un estudio prospectivo que incluye 65 pacientes, indican una mayor sensibilidad para la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) frente a la histología y al test de ureasa (72%, 66% y 62%, respectivamente).

Adicionalmente, la BM nos permite la tipificación precisa de la cepa infectante, es decir, se puede afinar mucho más el diagnóstico y, por lo tanto, el tratamiento y control del paciente. Es así que la tipificación de papilomavirus humano, ha permitido clasificar las infecciones en dos grandes grupos: alto riesgo y bajo riesgo de desarrollar cáncer de cuello uterino. Utilizando técnicas moleculares se puede definir poblaciones de alto riesgo que se beneficiarán de un programa de control y seguimiento más estrecho, con el fin de evitar la aparición de cáncer de cuello uterino.

Factores Pronósticos

Las alteraciones en oncogenes y en genes supresores tumorales, han sido estudiadas en diversos trabajos con el fin de valorar su utilidad como marcadores pronósticos independientes. A pesar de que los resultados son contradictorios y necesitan confirmación, algunos centros ya los están utilizando como factores pronósticos. Así, la detección de mutaciones en p53 en tumores vesicales es considerada una indicación para el tratamiento quimioterápico.

En cáncer colorrectal, un estudio prospectivo que incluyó 140 pacientes y que analizó la presencia de mutaciones en el oncogen K-ras y en p53, de forma independiente o consideradas en su conjunto, demostró que las mutaciones en los genes antes mencionados, son indicadores de mayor agresividad en los tumores, pero que no se comportan como factores pronósticos independientes. Estos resultados están en contraposición con otros estudios en los cuales parece quedar evidente que las mutaciones en p53 son un factor pronóstico independiente. Las diferencias pueden deberse, en parte, a las técnicas utilizadas para detectar mutaciones y, por otra parte, a diferencias propias de los tumores y pacientes estudiados. Está demostrado que existe diferencia entre los tumores de un país a otro, esto puede deberse a la exposición a diferentes carcinógenos y a factores relacionados con la raza de los pacientes.

Búsqueda de nuevas dianas terapéuticas

Los conocimientos adquiridos en los últimos años sobre el mecanismo de acción de proto-oncogenes, genes supresores tumorales y, aunque todavía muy poco, de los genes de reparación del DNA, han abierto un abanico de posibles nuevas dianas terapéuticas. La dilucidación de estos procesos, que constituyen la base molecular del cáncer, permite ahora el diseño de métodos de screening más racionales.

Gran parte de las proteínas codificadas por los oncogenes interviene en la transducción de la señal mitogénica que, tras la unión de los factores de crecimiento se dirige desde la membrana al núcleo celular. Por otra parte, en el propio control del ciclo celular es donde se concentra la acción de los más importantes genes supresores tumorales. Es obvio que el control de las rutas intracelulares de señalización que median los efectos de los oncogenes activados, o que son vulnerables a la inactivación de los genes supresores, representa una nueva y prometedora posibilidad de tratar el cáncer. Cualquier etapa de la vía de transducción de la señal mitogénica es, en teoría al menos, susceptible de ser inhibida. Es aún poco lo que se ha avanzado en la mayor parte de los distintos procesos; sin embargo, para la inhibición de determinadas vías, existen ya nuevos fármacos o drogas en fase experimental. Así, la acción de factores de crecimiento puede bloquearse con anticuerpos específicos o con antagonistas que inhiban la unión a sus receptores. Del mismo modo, es posible inhibir la actividad tirosín-quinasa de estos receptores con anticuerpos frente a ellos o compuestos que inhiban su acción enzimática. Existen inhibidores de receptores tirosín-quinasa de amplio espectro, como la genisteína, lavendustina A y la quercetina. La farnesilación de las proteínas ras, es esencial para su actividad y acción oncogénica. Este paso esta mediado por una enzima llamada Farnesil transferasa (FT). De ahí que gran parte de los esfuerzos están actualmente dirigidos a inhibir la acción de la FT. Se han identificado y se han probado diversos compuestos con resultados variables y, en algunos casos, alentadores para l control de células tumorales que contienen K-ras mutado.

Los conocimientos cada vez mayores sobre ciclo celular, traducción mitogénica desde la membrana al núcleo celular, regulación de la expresión génica, apoptosis, e invasividad y angiogénesis permiten el diseño de nuevos fármacos y estrategias terapéuticas cada vez más finas y mas dirigidas. Por tanto, la aplicación de éstos conocimientos deberá proporcionar nuevos compuestos útiles en el tratamiento de las enfermedades.

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