Cambios histológicos inducidos por ototoxicidad en ratas.
Citoarquitectura del Órgano de Corti y del Ganglio Espiral.

MSci. Sandra Rodríguez-Salgueiro1, Dra. Odelsa Ancheta-Niebla1, Dra. Rosa María Coro-Antich2, Téc. Tania Valdés-Prieto1, Téc. Yahima Harvey-Pedroso1, Lic. Armando Alvaré-Jaramillo3, Lic. Pavel Prado-Gutiérrez3 y Dra. Valia Rodríguez-Rodríguez3

Resumen
El daño inducido por drogas terapéuticas ototóxicas es una de las principales causas de pérdidas auditivas en humanos. El objetivo del presente trabajo fue analizar la influencia en el tiempo de un tratamiento ototóxico con kanamicina y furosemida sobre la citoarquitectura del órgano de Corti y del ganglio espiral de ratas adultas. Se prepararon cortes de cócleas de ratas sordas, sacrificadas a las 2, 4, 8 y 16 semanas de sordera y cortes de ratas sanas sacrificadas al inicio y al final del experimento (semanas 2 y 16). Las cócleas se estudiaron por Microscopia Óptica. Mediante morfometría de imágenes se determinó la densidad neuronal del ganglio espiral en las vueltas basal, media y apical de la cóclea. Se obtuvieron los siguientes resultados: 1) Se observaron cambios degenerativos en el órgano de Corti a partir de la segunda semana de sordera. 2) A partir de la octava semana, en las 3 vueltas cocleares el tratamiento ototóxico provocó reducción de la densidad neuronal del ganglio espiral acompañada por pérdida de los procesos periféricos que inervan el órgano de Corti, 3) La disminución de la densidad neuronal siguió un gradiente morfológico de ápice a base.

Introducción
Las drogas terapéuticas ototóxicas son una de las principales causas de daño en el sistema auditivo.1 En pacientes con sordera inducida por ototoxicidad, los implantes cocleares representan una importante vía de recuperar la audición.2 Para mejorar la eficiencia de los implantes cocleares es conveniente caracterizar morfológicamente, en modelos animales, las lesiones inducidas por drogas
ototóxicas en la cóclea.
La recuperación de la audición depende en gran medida del tiempo que media entre la aparición de la sordera y el momento en que se realiza el implante coclear. Durante este período de deprivación comienzan a producirse una serie de cambios degenerativos que empeoran con el tiempo y culminan en la muerte celular de los receptores auditivos (células ciliadas del órgano de Corti –OC-) y de  las células del ganglio espiral –GE– (primeras neuronas de la vía).3 La reducción de la población neuronal del GE afecta notablemente la eficiencia de los implantes, pues el funcionamiento de estos dispositivos está basado en la estimulación de los axones de esas neuronas.4 El objetivo de este trabajo fue analizar la influencia en el tiempo de un tratamiento ototóxico con kanamicina y furosemida sobre la citoarquitectura del OC y del GE de ratas adultas.

Materiales y Métodos
Animales
Se utilizaron 27 ratas machos Wistar adultas entre 250 y 300g de peso, procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio de La Habana.

Al inicio del experimento se comprobó la normalidad funcional de la vía auditiva de todos los animales mediante técnicas electrofisiológicas de potenciales evocados transientes de tallo encefálico (PEATC) y potenciales evocados de estado estable (PEAEE).
Los animales se dividieron en seis grupos de 4-5 animales cada uno: dos grupos de ratas no tratadas sacrificadas a las 2 y 16 semanas de iniciado el experimento (grupos controles), y cuatro grupos de ratas tratadas con ototóxicos sacrificadas a las 2, 4, 8 y 16 semanas de sordera.

Inducción de la sordera

Al inicio del experimento se administró una dosis de los ototóxicos kanamicina (400 mg/kg) y furosemid (150 mg/kg) simultáneamente, por vía intraperitoneal, a los 4 grupos tratados. Una semana después se comprobó la instauración de la sordera mediante PEATC y PEAEE. Se consideraron sordos los animales que presentaron umbrales sensoriales superiores a 105 dB nHL.

Procesamiento histológico
Los animales se fijaron por perfusión vascular en formalina al 10%. Se extrajeron las cócleas (una de cada animal) e inmediatamente se fijaron por perfusión perilinfática en paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2% (en buffer fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,4). Las cócleas se descalcificaron en EDTA al 8.3%, se pos-fijaron en tetróxido de osmio al 1% (en el mismo buffer fosfato), se deshidrataron en acetona y se incluyeron en bloques de resina Spurr. Se cortaron con cuchillas de vidrio en un ultramicrótomo Ultrotome III (LKB). Se obtuvieron cortes semifinos seriados según el plano horizontal de la cóclea.
Los cortes se tiñeron con Azul de Stevenel5 y se montaron en láminas de vidrio.6 En las regiones: basal, media inferior, media superior y apical de la cóclea (Fig. 1) se estudiaron de 5 a 10 cortes por cóclea, separados entre sí por 5 cortes.

Estudio cualitativo
Al microscopio óptico se estudió el estado del OC, de los procesos periféricos que lo inervan (dendritas de las neuronas del GE que se proyectan radialmente desde los cuerpos celulares hasta el OC) y de las neuronas del GE dentro del canal de Rosenthal (Fig. 2).

Estudio cuantitativo
Se empleó el sistema cubano para morfometría de imágenes Digipat.7 En cada imagen se determinó el área del canal de Rosenthal y se contaron las neuronas dentro del canal (Fig. 2). Se calculó la densidad neuronal (DN), expresada como neuronas por mm2, dividiendo el número de células entre el área del canal de Rosenthal. Se analizaron todos los valores de DN correspondientes a las vueltas: basal, media y apical de la cóclea de cada animal. Para la

vuelta media se tomaron todos los valores de las regiones media inferior y media superior.
Para cada grupo se compararon las DN entre vueltas. Para cada vuelta se compararon las DN entre grupos. Se comparó además la DN coclear promedio de las tres vueltas entre grupos.
En todos los casos se determinaron los valores de media y desviación estándar mediante estadística descriptiva. Las comparaciones se realizaron utilizando la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis y la prueba de comparaciones múltiples de Dunn.

Resultados
Estudio cualitativo
Órgano de Corti
En los animales controles, en las 3 zonas de la cóclea, la morfología se correspondió con los patrones de normalidad. 8 Se observaron las 3 filas de células ciliadas externas, de forma cilíndrica, con el extremo apical aplanado y el núcleo redondeado, localizado en la porción basal del cilindro. Las células ciliadas internas presentaron forma de pera con un núcleo redondeado central (Fig. 3A).

Figura 3. Órgano de Corti. A) Rata control. Células ciliadas internas (int), células ciliadas externas (ext). B) Daño intermedio, 4 semanas de sordera. C) Daño severo, 4 semanas de sordera. Barras = 50 m.

En los animales sordos, en las 3 regiones de la cóclea se comprobó la afectación de las células ciliadas a partir de la segunda semana. El OC presentó signos de degeneración, desde pérdida del patrón de organización celular que normalmente lo caracteriza (epitelio en mosaico) (Fig. 3B), hasta la sustitución del OC por una capa de células aplanadas (Fig. 3C).

Neuronas del ganglio espiral
En los animales controles y en los sordos de 2 semanas las neuronas del GE, muy próximas unas de otras,
ocuparon todo el espacio del canal de Rosenthal en las regiones apical (Fig. 4A) y media (Fig. 4B) observándose cierta escasez de neuronas hacia la región basal (Fig. 4C).
A partir de la cuarta semana de inducida la sordera comenzó a observarse cierta separación entre los cuerpos neuronales, que aumentó progresivamente hacia la semana 16, (Fig. 4D-I). Estas observaciones cualitativas se profundizan en el estudio morfométrico de este trabajo.

Figura 4. Cortes semifinos de cócleas de ratas en las vueltas: apical (A, D, G),

media (B, E, H) y basal (C, F, I) de la cóclea. A-C) Rata control, D-F) Rata sorda de 8 semanas, G-I)

Rata sorda de 16 semanas. Barras = 100 m.

Procesos periféricos
Los procesos periféricos se presentaron, en las 3 regiones cocleares, en forma de haces de fibras apretadas en la lámina espiral ósea en los dos grupos de animales controles (2 y 16 semanas) y en los sordos de 2 semanas (Fig. 4A-C). En cambio, a partir de las 4 semanas de sordera se observó un vaciamiento progresivo de la lámina espiral ósea por pérdida de fibras. Este fenómeno se observó en las 3 zonas de la cóclea (Fig. 4D-I) y se correspondió con la pérdida de somas neuronales.

Estudio cuantitativo
Entre los dos grupos controles (de 2 y 16 semanas) los valores de DN, tanto para las vueltas basal, media y apical, como la DN coclear promedio, fueron estadísticamente iguales. En lo adelante sólo se hará referencia a un grupo control en el que se incluyeron todos los valores de DN.

Figura 5. Densidad neuronal (valores absolutos) por vuelta coclear en cada grupo.

En los animales controles se encontró que las DN apical y media fueron estadísticamente iguales, y la DN basal fue menor. En los animales sordos de 2, 4 y 8 semanas las DN apical y media también fueron estadísticamente iguales, y la DN basal fue menor. En la semana 16 los valores de DN fueron los más bajos de esta serie. Dentro de este grupo la disminución de la DN sólo fue significativa entre las vueltas media y apical (Fig. 5).
En los grupos de animales sordos el comportamiento de la DN respecto al control fue diferente en las tres vueltas cocleares según avanzó el tiempo de sordera. En las vueltas basal y apical, hasta las 8 semanas de sordera no hubo diferencias significativas de la DN con respecto al control y a partir de ese momento se produjo una disminución progresiva y significativa de la DN. En la vuelta media se observó una reducción de la DN que fue signi- ficativa desde las 4 semanas de sordera y en esa vuelta

Figura 6. Densidad neuronal (expresada como porciento del control) según el tiempo de sordera.

coclear se produjeron las mayores pérdidas neuronales respecto al control (Fig. 6).
La DN coclear promedio no varió entre el grupo control y el grupo de animales sordos de 2 semanas. Sin embargo, a partir de las 4 semanas de sordera se produjo una disminución progresiva de la DN coclear promedio, que sólo fue significativa estadísticamente a las 8 y 16 semanas de sordera, con disminuciones de 36% a las 8 semanas y de 79% a las 16 semanas, con respecto al grupo control (Fig. 6).

Discusión
La mayoría de las ototoxinas, incluyendo los agentes quimioterapéuticos y antibióticos aminoglicósidos, tienen como blanco primario a las células ciliadas, pero afectan también a las neuronas del ganglio espiral.9, 10, 11
El aminoglicósido kanamicina induce una sordera sensorineural al provocar la pérdida de células ciliadas y posteriormente la degeneración de las neuronas del GE, lo que ha sido comprobado en varios modelos animales.12,13,14, 15,16 La furosemida induce daño ototóxico temporal de poca relevancia clínica,17 pero al igual que otros diuréticos, potencia la acción ototóxica de los aminoglicósidos.18 La efectividad del modelo de sordera empleado en esta investigación se ha comprobado en trabajos anteriores.19,20
En humanos, la mayoría de las sorderas son de origen sensorineural21 y se plantea que el daño neuronal del GE se debe a la pérdida del efecto trófico que ejercen las células ciliadas sobre esas neuronas.22
La escasez de los procesos periféricos que inervan el OC, conjuntamente con la pérdida de somas neuronales del GE en animales sordos, se ha descrito como signo de degeneración en varios modelos animales.23 Lo anterior también fue observado en el presente trabajo. La pérdida de las dendritas hace que el sitio de generación de potenciales de acción tenga que trasladarse hacia el soma de las neuronas del GE o al axón central, lo que tiene implicaciones para la aplicación de los implantes cocleares.24
En este estudio se observó una disminución signifi- cativa de la DN hacia la vuelta basal en todos los animales controles, aún cuando mostraban patrones electrofisiológicos de audición normal. Se ha observado un comportamiento similar a éste en ratones, que se ha atribuido al envejecimiento.25,26
En los animales sordos ocurrió una disminución significativa de la DN hacia la vuelta basal que sí se corresponde con la pérdida de audición demostrada por los PEATC y PEAEE. La base de la cóclea es la región donde se transducen las altas frecuencias; las bajas frecuencias se transducen en el ápice. El rango de frecuencias se distribuye tonotópicamente a lo largo del conducto coclear, desde la base hasta el ápice. El daño inducido por ototóxicos sigue un gradiente morfológico coclear que se expresa como mayor sensibilidad (pérdida de células ciliadasy neuronas) en la base que en el ápice.27 También se ha planteado que el gradiente de base a ápice observado en el daño inducido por aminoglicósidos puede ser resultado de una susceptibilidad diferencial de las células ciliadas externas a las especies reactivas del oxígeno que genera el agente ototóxico.28
En los grupos de animales sordos la disminución de la DN respecto al control fue mayor en la vuelta media que en las vueltas apical y basal. Un fenómeno similar ocurre durante la ototoxicidad inducida por el antibiótico aminoglicósido neomicina.29
La reducción significativa de la DN promedio observada en este trabajo a partir de la octava semana, coincide exactamente con lo obtenido por Hellier y colaboradores16 al provocar daño ototóxico a curieles mediante el tratamiento con kanamicina y diurético. Para mejorar la supervivencia neuronal del ganglio espiral se podrían emplear otros tratamientos, tales como el uso de ciertos factores neurotróficos y/o agentes antioxidantes para la prevención de la degeneración neuronal, así como la regeneración de las neuronas auditivas dañadas, lo que ha sido demostrado in vitro,30 en animales de experimentación31 y en pacientes.21
Estos enfoques para resolver la sordera demuestran la importancia que tiene la comprensión de los cambios morfológicos que están ocurriendo en la cóclea. La marcada similitud de los cambios patológicos del oído interno entre roedores y humanos32 permite aplicar los conocimientos obtenidos en modelos animales de sordera a los pacientes afectados por drogas ototóxicas.

Agradecimientos
Al Dr. Carlos Lariot Sánchez y al Ing. Michael Feston Cárdenas, por haber garantizado el funcionamiento de los equipos del Laboratorio de Microscopia Electrónica del Centro Nacional de Investigaciones Científicas empleados para la realización de este trabajo.
A los técnicos Oilime Prego y Teresa Diez, del Centro de Neurociencias de Cuba, por el cuidado de los animales.
Al Dr. Eddy Sánchez, del Hospital ¨Frank País¨, que gentilmente permitió que se realizara en su laboratorio la digitalización de imágenes.
A la técnica María Xiomara Gil, del Instituto de Neurología y Neurocirugía, por su cooperación.
A Nelsa Echevarría, del Centro de Neurociencias de Cuba, por su ayuda durante las búsquedas bibliográficas
necesarias para la escritura del manuscrito.

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